Flagella Boyanması

Flagella boyanması için çok genç ve güçlü kültürler temin edilmelidir. Genel olarak, agar 12 ila 24 saatlik üremeler iyi sonuçlar vermektedir. Stok kültürleri kullanılıyorsa, canlılığı geri kazanmak için çalışmadan önce birkaç gün boyunca günlük pasajlar yapılmalıdır. Kullanılacak besiyerleri bol su yoğunlaşması yapabilen yüzeye sahip olmalıdır. Besiyerinin yüzeyindeki yoğunlaşan su aynı özelliğe sahip ikinci bir besiyerine aktarılır. İkinci besiyeri de 24 saat inkübe edilir. Bu besiyerinin yüzeyindeki yoğunlaşan sudan alınan 1-2 damla steril distile su içeren tüpe aseptik olarak pasaj yapılır. Bakteri optimum çoğalma sıcaklığında 48-72 saat inkübe edilir. Yapılan çalışmalar bakterilerin 48-72 saat içerisinde flagellalarını döktüğünü göstermiştir. Yapılan bazı çalışmalarda 7 saatin yeterli olduğunu bildirilmektedir.

Kullanılacak lamel ve lam titizlikle temizlenmelidir. Sodyum veya potasyum hidroksit içeren sıcak temizleme çözeltileri kullanılmalıdır. Yıkamadan sonra zayıf hidroklorük asit ile nötralize edilmeli ve distile su ile durulanmalıdır. Lam ve lameller kullanıma kadar alkolde tutulmalıdır. Kullanımdan hemen önce forseps ile aleve tutularak alkol yakılmalıdır.

Yoğunlaşmış kültür suyunda çoğalmış bakterinin distile suda seyreltilmesi esastır. Lam kullanmak tercih edilmelidir. Lamın alkolden alev ile arındırıldıktan sonra ısısının bakterinin optimum sıcaklığına gelmesi sağlanmalıdır. Lamın iki kenarına kalem ile çizgi çekip bir ucuna kona 1 damla bakteri süspansiyonunun aşağı doğru iki çizgi arasında yayılarak ince bir tabaka oluşturmasına müsaade edilmelidir. Hızla kuruyabilecek kadar ince olmalıdır. Kağıt parçası ile yayma yapılabilir. Preparat ısı ile tespit edilmemelidir.

Yağlı lam ve lameller kötü sonuçların başlıca nedenidir. Diğer nedenler arasında; kültürün eski olması, kalın yayma, yavaş kuruma, yetersiz veya aşırı mordant veya boya alımı sayılabilir. En iyi sonuçlar Leifson ve Gray yöntemleriyle elde edilmiş gibi görünse de, diğer yöntemler de başarı ile kullanılmaktadır.

FL1.-Leifson boyası

• Üç lam hazırlayın.
• Mum bir cama yazar kullanarak slaytların uzun kenarları boyunca kalın, sürekli bir çizgi çekin ve bir ucunda elle tutulabilecek yaklaşık 2 cm boşluk bırakın. Bir ucuna büyük bir bakteri süspansiyonu damlası yerleştirin ve süspansiyon aşağı akacak şekilde slaytları süzün.
• 3. Havada kurutun.
• 4. Her slayta 0,8-1 ml Leifson boyası (B-24) ekleyin. İlk slaydı 8 dakika, ikinci slaydı 10 dakika ve üçüncü slaydı 12-15 dakika boyayın.
• 5. Musluk suyuyla yıkayın.
• 6. Kuruduğunda süzün ve inceleyin.
• 7. Karşı boya gerekiyorsa, 1:2000 boraks sulu çözeltisinde 1:1000 metilen mavisi ile 10 dakika boyayın.

FL2.-Leifson modifiye boyası

• Optimum büyüme sıcaklığının (genellikle oda sıcaklığı) altında, 16-20 saatlik taze bir eğik kültür hazırlayın.
• Eğimin cam tarafından aşağı doğru akıtarak 2-3 ml damıtılmış su ekleyin.
• 1 saat oda sıcaklığında bekletin.
• Bir Pasteur pipetiyle dip bölgesinden 5 veya 6 damla sıvıyı %10 formaline (%40 formaldehit) aktarın. Hafif bulanık bir süspansiyon yapın.
• 1 damla formalinli süspansiyonu eğimli bir şekilde temiz, kuru bir slayda pipetleyin, böylece damla yavaşça slayda doğru aksın. Slayt iyice temiz olmalıdır.
• Havada kurutun.
• Leifson boyasıyla dönüşümlü olarak boyayın (B-25). Dondurulmuş halde tutulursa, çalkalayarak boyanın homojenliğini sağlayın. Bir pipetle slayda 1 ml boya ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında bırakın.
• Musluk altında musluk suyuyla durulayın. Durulamadan önce lekeyi dökmeyin.
• Gerekirse suda %1’lik metilen mavisi solüsyonuyla karşıt boya yapın.
• Havada kurutun ve inceleyin.
• Bakteriyel gövdeler mavi; kamçılar kırmızıdır.

FL3.-Leifson-Hugh modifikasyonu

* Boyanacak organizmayı flagella besiyerine ekiniz.

Flagella broth
Tripton	10 g
Sodyum klorür	2,5 g
Dibazik potasyum fosfat	1 g
Distile su	1000 ml

Distile suda eritilen besiyerleri 16X125 mm ebatında tüplere 5-6 ml dağıtılır. Ağzı kapatılarak otoklavda 121 C 15 dakika steril edilir.

• Boyanacak bakteri besiyerine ekilir ve 1 gece inkübe edilir.
• Bakteri ekili tüpe 0,25 ml formaldehit (%37-40) ekleyin. Yavaşça karıştırın, oda sıcaklığında 15 dakika bekletiniz.
• Besiyerine distile su ilave ederek 2000 devirde 30 dakika santrifüj ediniz.
• Pasteur pipetini kullanarak üstteki sıvıyı dikkatlice atın. Tüpe 1 ml distile su ekleyin ve çökelti ile karıştırın.
• Tekrar aynı şartlarda santrifüj edin.
• Üstteki sıvıyı alın, çökeltiyi 1 ml distile suyla süspansiyon haline getirin.
• Süspansiyon hafifçe bulanık hale gelene kadar yavaşça damıtılmış su ekleyin. Tüpü ters çevirmeyin.
• Lamları %95 etil alkol solüsyonunda %3 HCl asit karışımına batırın. Temiz keten havluyla kurulayın. Lamları bunzen bekinin mavi alevli kısmında hafifçe ısıtın.
• Isıtmadan hemen sonra, bir mum kalemle slaydın buzlu ucundan yaklaşık üçte bir mesafede bir çizgi çizin. Slayt, mumu eritmek için yeterince sıcak olmalıdır.
• Slaytlar soğuduktan sonra, buzlu ucu yüksekte olacak şekilde “mum tarafı” yukarı bakacak şekilde hafif bir eğimde bekletin. Bu, buzlu ucu bir kalemle kaldırarak kolayca gerçekleştirilebilir.
• Öze kullanarak lamın üst kısmına bakteri süspansiyonu konulur ve kendiliğinden yayılması beklenir.
• Havada kurumaya bırakın. Isıyla sabitlemeyin.
• Slaytları bir boyama rafına yerleştirin.
• İşaretli alanına 1 ml boya Leifson modifiye flagella boyası (B-25) uygulayın.
• Boyama süresi genellikle 5-15 dakika aralığındadır. Boyama solüsyonunda çökelti görüldükten sonra boyanın 1 dakika kalmasına izin verin.
• Lamı olduğu yerde nazikçe yıkayın.
• Lamın arkasını silin ve incelemeden önce havada kurumaya bırakın veya kurulayın.

FL4.-Gümüş kaplama boyası

Bakterilerin hareket besiyerinde veya triptikaz soy agarında (TSA) yüzeyine ekiniz.

Oda sıcaklığında, 25 C’de (oda sıcaklığı) 18-24 saat inkübe ediniz.

• Temiz lam kullanınız veya önceki yöntemlerdeki gibi temizleyiniz.
• Lam 4 öze dolusu distile su koyunuz.
• Bakteri ekili tüplerin eğim yüzeylerinde biriken sıvı kısımdan bir öze dolusu alarak lamdaki suyla suyla karıştırınız.
• Her yaymayı 4 dakika boyunca solüsyon 1 (mordant) gümüş kaplama boyası (B-27) ile kaplayın.
• Damıtılmış suyla nazikçe durulayın.
• Solüsyon 2 (boya) (S-27) ile kaplayın.
• Buhar oluşana kadar ısı uygulayın; boyanın 4 dakika boyunca lam üzerinde kalmasına izin verin.
• Lamı yatay tutarak damıtılmış suyla nazikçe durulayın.
• Hava ile kurutun.

FL5.-Gray boyası

• 1. Genel yöntemde belirtildiği gibi yaymayı hazırlayın ve kurutun.
• 2. Gray mordant (B-28) 5-10 dakika uygulayın.
• 3. Distile suyla yıkayın.
• 4. Karbolfuchsin (B-15) ile 5-10 dakika boyayın
• 5. Musluk suyuyla yıkayın.
• 6. Kuruduğunda süzün ve inceleyin.

Kapsül Boyanması

Bakteri kapsülleri genellikle organizmaların gövdelerini çevreleyen boyanmamış haleler olarak tespit edilebilir. Ancak birçok durumda, kapsüllerin varlığını veya yokluğunu belirlemek için özel boyama yöntemleri gereklidir. Aşağıdaki yöntemler iyi sonuçlar verir.

KA1.-Hiss

• 1. Boyanacak malzemeyi eşit miktarda serumla karıştırın. İnce bir yayma yapın.
• 2. Havada kurumaya bırakın.
• 3. Alevde veya 1:10 seyreltilmiş ticari formalinde sabitleyin.
• 4. Hiss lekesi (S-30) veya %1 sulu kristal menekşe çözeltisi ile örtün ve birkaç saniye buharlaşana kadar ısıtın.
• 5. Lekeyi %20 sulu bakır sülfat çözeltisiyle yıkayın.
• 6. Havada kurutun ve inceleyin.
• Bakteri , hücreler ve arka plan mor. Kapsüller renksiz veya soluk lavantadır.

KA2.-MacNeal

• 1. İnce bir yayma yapın.
• 2. Havada kurumaya bırakın.
• 3. MacNeal tetrakrom boyası (S-31) ile örtün 3-5 dk.
• 4. Damıtılmış suyla dikkatlice yıkayın.
• 5. Havada kurutun ve inceleyin. Kapsüller renksiz veya soluktur.

KA3.-Lawson

• 1. Seyreltici kullanmadan kültürden direkt yayma hazırlayın.
• 2. Havada kurutun.
• 3. Filmi mordan (S-32) ile örtün 30 sn.
• 4. Lamı metil alkol ile yıkayın.
• 5. 20 damla boya (S-33) ile örtün 2 dk. 6. 30 damla damıtılmış su ekleyin, boyayı slayt üzerinde suyla karıştırın ve 10-20 dk. etki etmesini bekleyin.
• 7. Damıtılmış suyla durulayın.
• 8. Slaydı boşaltın ve kuruduğunda inceleyin.
• 9. Kapsüller renksiz veya soluktur.

Granül Boyanması

Granül boyaları bakteri morfolojisinin incelenmesinde kullanılır. Smearlar kurutulmalı ve granül boyası uygulanmadan önce alev üzerinde sabitlenmelidir.

GR1.-Ljubinsky

• Ljubinsky boyası (S-34) ile boyayın 2 dk.
• Damıtılmış suyla yıkayın.
• Bismarck kahverengisi (S-14) ile boyayın 30 sn.
• Damıtılmış suyla yıkayın.
• Kurutun ve inceleyin. Granüller koyu mor; gövdeler kahverengimsi.

GR2.-Metilen mavisi

• Metilen mavisi (S-20 veya S-22) uygulayın 1-2 dk.
• Damıtılmış suyla yıkayın.
• Havada kurutun ve inceleyin.
• Granüller koyu mavi; gövdeler daha açık mavidir.

GR3.-Gohar

• Metilen mavisi (S-20) ile boyayın 5 dk.
• Hızlıca l: 1000 sülfürik asitle renk giderin.
• Hızlıca damıtılmış suyla yıkayın.
• Gram iyot (S-6 veya S-7) ile 10 saniye boyayın.
• Damıtılmış suyla yıkayın.
• Damıtılmış suda %1 eozin ile 30 saniye karşı boyayın.
• Damıtılmış suyla yıkayın.
• Havada kurutun ve inceleyin.
• Granüller koyu; gövdeler sarımsıdır.

GR4.-Neisser

• 1. Neisser solüsyonu (S-35) ile 30-60 saniye boyayın.
• 2. Damıtılmış suyla yıkayın.
• Bismarck kahverengisi (S-14) ile 10 saniye boyayın.
• Damıtılmış suyla yıkayın.
• Havada kurutun ve inceleyin.

GR5.-Albert

• Albert boyası A Solüsyonu (B36) ile 5 dakika boyayın.
• Süzün, yıkamayın.
• Albert boyası A Solüsyonu (B36) ile 1 dakika boyayın.
• Çeşme suyuyla kısa bir süre yıkayın.
• Kurulayın ve inceleyin.
• Metakromatik granüller siyaha boyanır, difteri bakteri çubukları koyu yeşilden siyaha ve kendisi açık yeşile boyanır.

Sporların Boyanması

Özel bir yöntem kullanılmaz ancak Gram veya basit bir bakteri boyası uygulanırsa, sporlar bakteri gövdesinde boyanmamış delikler olarak görünür. Sporları daha net bir şekilde görselleştirmek için özel yöntemler uygulanmalıdır

SP1.-Dorner

• Lam üzerine 3-4 damla distile su kullanarak yoğun bir bakteri süspansiyonu hazırlayın.
• 3-4 damla Ziehl-Neelsen karbolfuchsin (B-15) ekleyin. 10-15 dakika kaynatın.
• Lamdaki süspansiyondan bir öze dolusu başka bir lama alınız. Üzerine bir öze dolusu nigrosin, Dorner boyası (B38) koyarak karıştırın.
• İnce bir yayma yapın.
• Sporlar kırmızıya boyanırken bakterinin kendisi boya almaz. Arka plan gridir.

SP2.-Wirtz-Conklin

• İnce bir yayma yapın ve alevde tespit edin.
• Sulu %5 malasit yeşili ile preparatı kaplayın.
• 3-6 dakika buhar çıkana kadar ısıtın.
• Distile suyla yıkayın.
• Sulu %0,5 safranin veya sulu %5 merbromin (Mercurochrome) ile 30-60 saniye boyayın.
• Distile suyla yıkayın.
• Kurulayın ve inceleyin.
• Sporlar yeşil, bakteri pembe boyanır.

SP3.-Abbott

• İnce bir yayma yaparak alevde tespit edin.
• Metilen mavisi (S-20 veya S-22) ile örtün ve ısıtın, lekeyi birkaç kez kaynama noktasına getirin ancak sürekli olarak 1 dakika boyunca değil.
• Distile suyla yıkayın.
• Eozin Y alkolde doymuş çözeltisini 1:10 distile su ile sulandırın.
• Preparatın üstünü örtün 5-10 saniye bekleyin.
• Distile suyla durulayın.
• Kurulatın
• Balsam ile örtün ve inceleyin.
• Sporlar mavi, bakteri gövdeleri pembe olarak boyanır.